Factores que influyen en la reacción antígeno anticuerpo
Los
factores que condicionan la reacción antígeno anticuerpo dependen en gran
medida de la propia naturaleza de las moléculas que intervienen en la reacción.
Estos
factores son:
1.- Los
puentes hidrógeno. Estas uniones se
forman entre los átomos de hidrógeno , cargados positiva mente, y los átomos
elecronegativos del oxigeno y el nitrógeno.
2.- Las
fuerzas electrostáticas entre los grupos carboxilo (COO) con carga negativa y
los grupos amino NH2, cargados positivamente.
3.-
Las interacciones hidrófobas inducidas
entre grupos no polares, como los ácidos aromáticos.
4. Las
fuerzas de Van der Waals, debidas a los movimientos de los electrones de
moléculas vecinas.
5.-
Inducción estructural. El modo en
que el anticuerpo se ajusta al antígeno, es similar a cómo lo hace la
llave a la cerradura. Pero esta idea no explica completamente la unión Ag/Ac.
Existe además lo que se denomina
inducción conformacional. El anticuerpo no tiene un papel pasivo como la
llave en la cerradura, sino que se produce una adaptación del entrono del anticuerpo al antígeno en la zona de unión.
Todas
estas fuerzas son de baja energía, pero
suficiente para mantener la unión entre las dos moléculas. La propia naturaleza
de las moléculas Ag/Ac facilita la unión. Cuando una molécula de anticuerpo de
modifica por acetilación, el anticuerpo pierde su capacidad aglutinante. Cuando
se modifica selectivamente un aminoácido, como la tirosina, se produce un
inactivación de la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno.
La unión
entre un antígeno y un anticuerpo depende en gran medida de dos propiedades que
posee el anticuerpo y que son la afinidad y la avidez.
Afinidad y avidez
La afinidad de un anticuerpo se
refiere a la energía de enlace potencial contenida en cada uno de los sitios de
combinación del anticuerpo. En ella participan todas las posibles interacciones
con el antígeno que están determinadas
por el número y el tipo de grupos químicos reactivos presentes en el sitio de
combinación.
La afinidad es la
energía de enlace contenida en cada uno de los lugares de unión del anticuerpo,
fragmento (Fab)2. Una IgG tendrá dos sitios de unión y una IgM tendrá 10. En
este sentido las inmunoglobulinas son multivalentes.
La avidez se
refiere más bien al grado de interacción entre un anticuerpo y su antígeno
homólogo. Por ejemplo, pudiera darse el caso de que un anticuerpo de la clase
IgG y uno de la clase IgM tuvieran la misma afinidad por un antígeno (igual
energía de enlace), sin embargo, por razones relacionadas con su estructura, la
avidez de ambos anticuerpos es obligadamente diferente. Los anticuerpos IgM
tienen una estructura polimérica y, por tanto, un mayor número de sitios de
combinación (diez, para ser exactos, aunque funcionan como anticuerpos
pentavalentes). Esto hace que los anticuerpos de la clase IgM tengan mayor
avidez que los anticuerpos de la clase IgG, aun cuando ambos estén dirigidos
contra el mismo determinante antigénico.
La avidez
es la fuerza global de unión de todos los sitios ocupados en la
combinación antígeno/anticuerpo. A
igualdad de afinidad, la IgM tendrá mas avidez que la IgG (10 sitios de unión
frente a 2)
La
reacción antígeno anticuerpo se caracteriza, también, por dos factores fundamentales, que son especificidad y
reversibilidad.
- La
especificidad significa que un antígeno solamente es reconocido por un
anticuerpo especifico y los anticuerpos solamente reconocen a los antígenos que
han determinado su síntesis.
- La
reversibilidad. El complejo antígeno/anticuerpo se forma por una unión no covalente, reversible por el calor o por el pH ácido.
La
reacción antígeno/anticuerpo, responde a la siguiente formula
Ag + Ac <----->Ag-Ac + calor
La
afinidad de un anticuerpo frente a su antígeno se puede cuantificar por la
constante de asociación intrínseca o
constante de afinidad según la ley de acción de masas.
Los valores muy elevados de anticuerpos afines colocan a la reacción
antígeno/anticuerpo entre los métodos mas sensibles para la medida de antígenos o de anticuerpos.
Reacciones inmunológicas
Los
métodos inmunológicos se pueden clasificar en función del tipo de reacción que
midan.
- Reacciones primarias. La reacción
antígeno/anticuerpo se puede ver directamente, tal es el caso de la aglutinación,
precipitación o la fijación de
complemento.
- Reacción secundaria. La reacción
no es visible a simple vista , son necesarios aparatos sofisticados y reactivos
marcados, radioelementos, R.I.A. (Radioimmunoassay), enzimas, Enzimoinmunoanálisis, E.I.A. o un fluorocromo
e inmunofluorescencia.
Reacción terciaria. Son las
reacciones que se realizan “in vivo”. El
resultado de la reacción depende de la reactividad del propio sujeto.
Reacción de precipitación
Un
complejo antígeno/anticuerpo no se hace insoluble, sino después de la formación
de una red tridimensional de
moléculas de antígeno unidas al
anticuerpo, según la teoría de la red de
Marrack.
Esta
reacción precisa de los siguientes
elementos:
- Un antígeno trivalente, cuando
menos, para que se puedan puentear
numerosas
moléculas de antígeno por los anticuerpos.
- Un anticuerpo bivalente
- Condiciones físicas favorables a
la reacción de precipitación tales como
anticuerpos poco glicosilados. Las IgG contiene un 3% de glúcidos siendo bastante precipitantes. Las IgM contiene un
10% de glúcidos y son menos precipitantes.
Precipitación en medio liquido
Curva de precipitación
El método
clásico de Heidelberger y Kendall no es
muy utilizado pero resulta útil para explicar la reacción, ya que muestra la
aparición y la desaparición del precipitado en función de las concentraciones
relativas de antígeno y de anticuerpo.
En una
serie de tubos ponemos cantidades constantes de una solución de anticuerpo.
Añadimos cantidades crecientes de antígeno en un volumen igual de anticuerpo.
En un
primer momento de la reacción, con exceso de
anticuerpo, la precipitación solamente aparece cuando existe la concentración necesaria para que se forme
la red tridimensional de gran talla. En
los tubos intermedios la precipitación es máxima y correspondería a una
relación ideal antígeno/anticuerpo, en la proporción de una molécula de anticuerpo por dos moléculas de antígeno.
En los
últimos tubos, el precipitado desaparece
por un exceso de antígeno. Los anticuerpos relativamente poco numerosos, con
relación a los antígenos , no forman complejos trimoleculares, Ag2Ac, con las
moléculas de antígeno libre,
insuficientes para un complejo tridimensional de gran talla.
Nefelometría
La
nefelometría es una de las aplicaciones de la precipitación en medio líquido.
El nefelómetro utiliza una luz intensa
monocroma que resulta difractada por los
inmunocomplejos de la reacción antígeno/anticuerpo. La medida de inmunocomplejos antígenos/anticuerpos resulta
fácil y reproducible gracias, a una curva estándar. La aplicación de estos métodos requiere la utilización de
reactivos en concentración por encima
del mg/litro. Las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgE, los factores del
complemento C3, C4, C5, FB, C1q, el factor reumatoide y otros factores de la
inflamación pueden ser cuantificados por
este procedimiento.
Precipitación en
medio sólido
La
utilización en medio sólido, agarosa, en
el que los dos elementos de la reacción antígeno y anticuerpo, pueden difundir,
o donde uno solo difunde y el otro está incluidos en el agar, permite
visualizar la reacción antígeno anticuerpo
por el arco de precipitación que se forma.
Inmunodifusión doble de Ouchterlony
Antígeno y
anticuerpos (inmunosuero) se colocan en
el agar en sendos pocillos, enfrentados.
Después de la difusión, entre un día y una semana, se analizan los arcos de
precipitación que se han formado. Cada arco indica un sistema
antígeno/anticuerpo diferente.
Si la
reacción se realiza en tres pocillos, es posible establecer una relación de
identidad. Si se desea conocer la
especificidad de un anticuerpo precipitante de un suero a estudiar, es
suficiente colocar al lado un suero de
referencia frente a la solución del antígeno. En este sistema se pueden
dar tres tipos de reacciones:
- Reacción de identidad. El arco de precipitación de un suero a estudiar y el del suero de
referencia forman un arco redondeado.
Los anticuerpos tiene las misma especificidad, es decir, reconocen el mismo
antígeno.
- Reacción de identidad parcial. Los
dos arcos de precipitado forman un saliente (espuela), arco suplementario que
se prolonga en uno de los dos sueros. Este tipo de imagen se observa únicamente
con antígenos que contiene epítopos comunes y epítopos diferentes , por ejemplo
IgM kappa e IgA kappa.
- Reacción de no identidad. Los dos arcos se
cruzan el uno sobre el otro.
Este
procedimiento resulta muy útil para la
identificación de anticuerpos contra
proteínas de núcleo celular y otros autoanticuerpos.
Inmunodifusión radial de Mancini y
electroinmunodifusión
Uno de los
dos reactivos esta incluido en el agar. El otro elemento de la reacción se
deposita en un pocillo. Su difusión en el agar “contra” el antisuero incluido
en el agar da un halo de precipitación. En esta técnica la difusión es
espontánea y radial. La cantidad de antígeno o anticuerpo medido es
directamente proporcional a la
superficie limitada por el precipitado, o al producto de la largura de los dos
ejes perpendiculares.
En la
electroinmunodifusión , el reactivo a medir, antígeno o anticuerpo, migra bajo
la acción de una corriente eléctrica. Al termino de la migración se produce una
precipitación en forma de huso (rocket). La cantidad de elemento es
proporcional a la longitud del huso. Este método es mas sensible que el
anterior, pero consume mas reactivo.
Inmunmoelectroforesis
Este
método, muy utilizado anteriormente,
tiende a ser sustituido por la inmunofijación, para diferenciar las
inmunoglobulinas monoclonales. Por la dificultad para determinar el tipo de la
cadena ligera, de una macroglobulinemia
IgM tapada por la IgG.
La
inmunoelectroforesis de Grabar y Williams se hace en dos tiempos:
- En un pocillo hecho en el agar se
deposita una gota del suero a estudiar, orina concentrada, e incluso L.C.R. La
muestra se hace correr en un campo eléctrico para separar las cinco bandas
típicas de proteínas , albúmina, la fracción alfa-1, la fracción alfa-2, la
fracción beta y la fracción gamma (en el caso del suero)
- En un segundo tiempo en un
canalículo paralelo al sentido de la migración
se coloca un suero contra proteínas humanas totales, en otro un
anticuerpo contra cadena ligera kappa,
en otro anticuerpo contra cadena ligera lambda, en otro antisuero contra cadena
gamma, IgG, en otro antisuero contra cadena
alfa, IgA, y en otro antisuero contra cadena µ, todo en la misma placa.
Estos antisueros se dejan difundir, con
lo que aparecerán los distintos arcos de precipitación correspondientes a cada
una de las proteínas del suero.
La
inmunoelectroforesis es un método cualitativo moderadamente sensible que permite visualizar una treintena de
proteínas séricas. Una inmunoglobulina monoclonal se caracteriza por la
modificación del arco de precipitación
con doble curvatura con un arco mas espeso, mas incurvado y muy próximo al
canal del antisuero ( inmunosuero).
Inmunofijación
Este
método no es verdaderamente una inmunoprecipitación. En un primer tiempo los
constituyentes del suero a estudiar, son separados en agar como en la
inmunoelectroforesis. En un segundo tiempo, inmunosueros específicos son
aplicados a cada una de las calles de la placa. Después de un lavado se tiñen
las bandas. Esta técnica es mas sensible mas especifica y mas rápida que la
inmunoelectroforesis, y permite identificar
cadenas ligeras de una cadena IgM
monoclonal.
Reacción de aglutinación
En la
reacción de aglutinación la interacción antígeno anticuerpo necesita la
presencia de partículas, células, bacterias, partículas de látex, particular de
poliestireno, cristales de colesterol etc, como soporte. La reacción de
aglutinación es visible a simple vista. Los anticuerpos del tipo IgM con 10 sitios anticuerpo potenciales y sobre
todo su tamaño grande son excelentes aglutinógenos, mientras que las inmunoglobulinas
del tipo IgG son peores aglutinógenos.
Existen
tres tipos de reacciones de aglutinación:
-
Aglutinación directa.
El
antígeno es un constituyente de la membrana de la partícula y los anticuerpos
en general son de clase IgM. La puesta en contacto de al partícula y el
aglutinógeno , produce la reacción de aglutinación.
La
reacción de aglutinación se emplea para determinar los grupos sanguíneos ABO,
las aglutinaciones frías, la reacción de Paul-Bunnel Davidshon, empleando hematíes de
carnero y la reacción de Widal para la
investigación de anticuerpos contra Salmonella typhi y S. paratyphi A, B y C.
En el caso de la infección por Salmonella, se pueden identificar anticuerpos
contra antígenos somáticas “O” y antígenos flagelares “H”.
Aglutinación indirecta o pasiva
El
antígeno se fija espontáneamente o artificialmente por procedimientos químicos
a un soporte físico, partículas de
látex, glóbulos rojos formolados, cristales de colesterol, y los anticuerpos
correspondientes aglutinan sobre el
soporte.
Esta
técnica se emplea en la investigación del factor reumatoide o en la
identificación de anticuerpos del tipo
IgM contra IgG, modificados en la fijación con sus antígenos o agregados. En la reacción
de Waaler- Rose, se fijan IgG de conejo
sobre glóbulos rojos de carnero. En la reacción de látex lo que se fijan
son IgG humanas agregadas por el calor.
Otras pruebas detectan anticuerpos contra microsomas de tiroides y contra
tiroglobulina, fijando los antígenos sobre hematíes. Para el diagnostico de la
sífilis se emplea la reacción de VDRL
(Venerean Deseases Recherche Laboratory), que emplea cristales de colesterol
recubiertos de cardiolipina.
Aglutinación artificial
Los
anticuerpos del tipo IgG no suele ser aglutinantes, por lo que un artificio
tiene que ser introducido para disminuir la constante dieléctrica del medio (
medio albuminoso), para disminuir la carga eléctrica de las células (tratadas por los enzimas) o para aumentar la
fuerza del anticuerpo por un segundo anticuerpo (Prueba de la antiglobulina o
prueba de Coombs).
La aglutinación
artificial tiene aplicaciones en el tipaje del factor Rh, que se determina con
un anticuerpo anti-D en medio
albuminoso.
Diagnostico
de anemias hemolíticas autoinmunes,
empleando el test de Coombs directo, investigando la fijación antes de la extracción
en el paciente de anticuerpos no aglutinantes del tipo IgG, mas raramente del
tipo IgA o de complemento en la superficie de los hematíes del enfermo. Después
de la extracción y el lavado de los hematites del paciente es suficiente añadir
una antiglobulina polivalente o
específica anti-IgG o contra complemento, para revelar las globulinas fijadas
sobre los hematíes.
Investigación de incompatibilidad materno-fetal
A lo largo
del embarazo o en el momento del parto, se pueden encontrar anticuerpos contra
hematíes del recién nacido empleando una prueba de Coombs indirecto. En la
reacción se ponen en contacto suero de la madre contra un panel de hematíes. En
el recién nacido los anticuerpos
maternos ya fijados en los hematíes, se
ponen en evidencia por un test de Coombs directo.
Prueba de la inhibición de la hemaglutinación
Esta
técnica se emplea en la investigación de anticuerpos contra el virus de la
rubéola.
La
hemaglutinina de virus, tiene la
capacidad de aglutinar hematíes de diversas especies. El suero de una persona
sospechosa de haber sido infectada con el virus de la rubéola se pone el contacto con la hemaglutinina viral.
Después de un periodo de incubación, se añaden
hematíes. Si la persona tiene anticuerpos, se fijarán a la hemaglutinina e
inhibirán la hemoaglutinación, es decir la unión de la hemoaglutinina viral a
los hematíes.
Reacciones que utilizan el complemento
La
reacción de fijación del complemento permite detectar cualquier reacción antigeno/anticuerpo que fije el complemento,
tal es el caso de los anticuerpos del
tipo IgM, IgG3 e IgG1. Se trata de una reacción larga y difícil de realizar ,
en la que intervienen muchos factores, y en estos momentos se empela únicamente
para detectar anticuerpos contra virus.
La
reacción se realiza en dos tiempos.
- En un primer tiempo el suero a
estudiar se descomplementa, calentándolo a
56ºC durante 30 minutos. Seguidamente se pone en contacto con el antígeno
y con una cantidad conocida de
complemento de cobayo (3 unidades).
- En un segundo tiempo se añade un
sistema de revelado. Este segundo sistema inmune esta formado por hematíes
de conejo sensibilizados con
anticuerpos, del tipo IgG hemolizantes contra hematíes de conejo, (anticuerpos
fijados al hematíe que no los lisarán hasta que se una el complemento)
Si los
glóbulos rojos de carnero no se hemolizan,
el complemento ha sido utilizado en la primera parte de al reacción y la fijación de complemento es positiva.
Si la
primera reacción no ha sido positiva, las 3 unidades del complemento quedan libres y lisan los hematíes de carnero sensibilizados,
con lo que la reacción se da como negativa.
Inmunofluorescencia directa
Los
antígenos tisulares pueden señalarse empleando anticuerpos marcados con
fluoresceína. Los anticuerpos marcados se pueden aplicar directamente sobre
cortes de tejidos o biopsias. Después de lavar el tejido , el corte se observa
en un microscopio de fluorescencia, lo que
permite observar inmunocomplejos
de inmunoglobulinas o de complemento.
Empleando reactivos específicos se pueden caracterizar diferentes
constituyentes del tejido u observar una reacción inmunológica ocurrida “in vivo” por deposito
de inmunoglobulinas o complemento.
Esta
técnica es extraordinariamente útil en Inmunología.
Inmunofluorescencia indirecta
Esta
técnica se emplea para detectar anticuerpos solubles en suero. La reacción se
produce sobre un sustrato especifico, generalmente un corte de tejido o una
suspensión celular fijada sobre un porta.
Esta es
una técnica muy empleada para detectar autoanticuerpos en procesos autoinmunes.
La técnica
se realiza en dos tiempos: primero se añade el suero que contiene los
anticuerpos a investigar, se deja incubar, se lava y, seguidamente, se añade un
segundo anticuerpo marcado con isocianato de fluoresceína. La reacción se
visualiza examinado los agregados antígeno/anticuerpo con un microscopio de
fluorescencia.
Métodos inmunoenzimáticos
La idea es
la misma que en el caso de los métodos radiométricos, pero con la diferencia de
que el trazador radiactivo se sustituye por un marcador enzimático, peroxidasa,
fosfatasa alcalina, u otros. Inicialmente la reacción antigeno/anticuerpo se
marca con un anticuerpo contra inmunoglobulinas humanas que a su vez está unido a una enzima. Después de un
lavado, se añade el sustrato específico para la enzima. La enzima hidrolizará
el sustrato, lo que genera una reacción
coloreada. El color producido se mide en un espectrofotómetro, a una longitud
de onda determinada.
De la
misma manera que en los sistemas radiométricos, la reacción se realiza sobre una fase sólida en la que se
fija en exceso un anfígeno o un
anticuerpo.
El método
mas empleado es el denominado E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent).
Cuantificación de antígenos
Anticuerpos
en exceso y no marcados se fijan a la
fase sólida. Seguidamente se añade el suero a investigar, a la vez que se hace
una curva de calibración. Después de un lavado se añade un segundo anticuerpo,
unido a una enzima, que reconoce un epítopo del antígeno. Después de un segundo
lavado se añade el sustrato específico para la enzima. La reacción coloreada se
mide en un espectrofotómetro. La cantidad de color es proporcional a la
concentración de antígeno presente en la
muestra.
Cuantificación de anticuerpos
El sistema
es idéntico al sistema radiométrico, con empleo sucesivo de un antígeno en
exceso, no marcado y fijado a una fase sólida. Una vez añadido el suero
problema, se incuba y, posteriormente se añade un segundo anticuerpo, contra el
anticuerpo, marcado con una enzima. Una reacción coloreada indicará la cantidad
de anticuerpo fijado.
Inmunoblot
Es un
método de Biología Molecular que se viene utilizando desde 1981. Presenta la
ventaja de que permite identificar estructuras antigénicas en función de su
peso molecular.
La técnica
comporta 3 etapas.
- Migración electroforética de una mezcla antigénica en un gel de
poliacrilamida. A la solución de proteínas se le añade SDS, para acidificar las
proteínas y hacerlas electronegativas, y
2-mercaptoetanol para disociar las puentes disulfuro. Después de la
electroforesis las proteínas se han separado en función de su peso molecular,
con una migración inversamente proporcional a su diámetro y a la raíz cuadrada de su peso molecular.
- Transferencia del gel de
poliacrilamida sobre una hoja de papel de nitrocelulosa. Esta operación se
puede hacer de forma artesanal o
empleando un aparato de
electrotransferencia.
-
Fijación y revelado de los anticuerpos
correspondientes sobre la banda de nitrocelulosa. La muestra en la que se
quieren identificar los anticuerpos específicos se añade sobre el papel de
nitrocelulosa. Los anticuerpos, si están presentes, se unirán a los diferentes
antígenos de la tira, según su
especificidad. Después de un lavado los
anticuerpos fijados son revelados por
una antiglobulina marcada con una enzima.
Este
método, es extraordinariamente útil para confirmar la presencia de anticuerpos
contra el VIH y otras infecciones.
El
Inmunoblot es una técnica muy sensible y muy específica.
Criterios de valoración de una técnica
El valor
de una técnica está condiciono por cuatro valores:
- Sensibilidad. Frecuencia de una
prueba positiva en una infección
- Especificidad. Frecuencia de una
prueba negativa en personas sanas, para un determinado antígeno.
- Valor predicativo positivo.
Frecuencia de la enfermedad entre las pruebas positivas. Este valor depende de
la prevalencia de la enfermedad en la población
estudiada por comparación con las poblaciones vecinas.
- Valor predicativo negativo.
Ausencia de la enfermedad entre las pruebas
negativas.
Pruebas “in
vivo”
Pruebas
cutáneas.
- Pruebas epicutáneas. El
antígeno se aplica directamente sobre la
piel en un parche impregnado con el antígeno o el alergeno. La prueba tiene
buena sensibilidad y especificidad.
La lectura
se efectúa a las 48-72 horas, sencillamente quitando el parche. Un resultado
positivo se traduce en la aparición de un eritema y una induración. Esta prueba se utiliza
para estudia las reacciones de
hipersensibilidad retardada y para detectar alergenos responsables de las
dermatitis de contacto.
- Pruebas intraepidérmicas. El antígeno se introduce en la
piel utilizando una lanceta. El antígeno
penetra en la epidermis. Esta prueba es muy sencilla, no traumática, pero
requiere una cierta experiencia. La lectura se realiza a los 15 minutos y a las
6 horas, en los casos de hipersensibilidad inmediata. Esta prueba es muy
utilizada en alergia, empleando alergenos, de gramíneas, polvo domestico,
proteínas animales, productos industriales y medicamentos.
- Pruebas intradérmicas. El antígeno se introduce en la epidermis
con una jeringuilla, provocando una pequeña burbuja sobre al piel. La prueba es
sencilla de hacer aunque requiere algo de práctica, pero es peligrosa, ya que
puede provocar shock anafiláctico. La prueba hay que hacerla con la precaución
de tener adrenalina a mano.
- Pruebas de provocación. Pueden ser nasales o bronquiales.
Gracias a un aparato que mide el aire inspirado por la nariz, se mide la
obstrucción de la nariz antes y después de inhalar el alergeno.
- Estudio de lavado bronquioalveolar. El estudio del líquido
alveolar permite conocer las
poblaciones celulares y los productos de secreción del liquido aspirado.
Estudio de la respuesta humoral
Estas
pruebas se basan en métodos que están contrastados y homologados por estándares
internacionales. La respuesta humoral se puede estudiar realizando una serie de
pruebas que se pueden agrupar en cinco grupos:
- Inmunoglobulinas y proteínas
inflamatorias. La cuantificación de las inmunoglobulinas puede orientar en una
inmunodeficiencia y en una proliferación con
producción de componentes monoclonales, consecuencia de una
linfoproliferación de plasmocitos B. Un proceso infeccioso se traduce en un
aumento de las proteínas de la inflamación y de una hipergammaglobulinemia.
La
sistemática de laboratorio sería la siguiente:
- Electroforesis de proteínas en
suero o en orina. La electroforesis puede revelar una hipergammaglobulinemia o
proteínas monoclonales en la región de las gamma y en la zona beta y mas raramente
en la zona alfa. Este procedimiento detecta proteína cuando están a una
concentración > a 4g/l.
- Inmunoelectroforesis, o
inmunofijación. Se pueden aplicar a suero, orina y L.C.R.. Una deficiencia de
IgG, IgA e IgM puede ser evidenciada
cualitativamente. Una proteína monoclonal puede tener su variación en
cadena ligera y cadena pesada. Se puede
detectar una cadena ligera libre.
- Cuantificación de proteínas séricas, en orina, suero o L.C.R. La nefelometría es un método simple
automatizable y de una gran precisión. La inmunodifusión radial es menos
empleada que la nefelometría. Resulta
también interesante cuantificar las subclase de inmunoglobulinas, para poder
detectar una posible deficiencia de IgG2.
El estudio
del L.C.R., permite establecer el
cociente IgG/albúmina y hacer la exclusión de una IgG sintetizada por
los linfocitos cerebrales (detección de
bandas oligoclonales). En estos casos es necesario el estudio del LCR, junto con suero del mismo paciente. Si la banda oligoclonal
se encuentra en el suero y en el LCR, es de origen hemático, pero si la banda
aparece en el LCR y no en el suero es de origen intratecal y ha sido
sintetizada por los linfocitos del LCR. Este estudio es particularmente
importante en el diagnostico de la esclerosis
en placas y en algunas encefalitis desmielinizantes.
En el caso
de que se sospeche un proceso alérgico, habría que cuantificar la IgE total y
la IgE especifica frente al alergeno que se sospeche como responsable de dicho
proceso alérgico, si bien el valor clínico en algún caso puede ser limitado. Esta prueba estaría
indicada cuando las pruebas cutáneas están contraindicados o son de poca
utilidad, en casos de reactividad cutánea anormal, dermatitis severa en los niños, tratamientos
antihistamínicos , o riesgo de reacciones severas.
La
investigación de anticuerpos precipitantes es de gran utilidad en la alveolitis
alérgica. Estos anticuerpos se pueden detectar por métodos sencillos como la
inmunodifusión de Ouchterlony o por
métodos mas costosos E.L.I.S.A o R.I.A.
Los antígenos a investigar dependen de la
historia clínica del paciente, (Micropolyspora faeni en el caso del
pulmón de granjero, albúmina aviar en el caso de sospecha de pulmón del cuidador de aves, Candida
albicans en caso de candidiasis, Aspergillus fumigatus en caso de
aspergilosis.)
El complemento
La
actividad del complemento se puede medir tanto en la vía clásica como en la vía
alterna. Investigando CH-50 tenemos una idea de la actividad lítica. Esta
técnica proporciona una idea bastante precisa de la actividad lítica total del
complemento. La valoración de la técnica
se realiza estableciendo la dilución del suero (que contiene el
complemento) que es capaz de lisar el 50% de hematíes recubiertos con
anticuerpos contra hematíe, (estos anticuerpos contra hematíe se denominan
hemolisinas) También es posible cuantificar algunos de los componentes
principales del complemento, como C3, C4, C5, FB, por nefelometría.
Separación por citometría de flujo
Estos
sistemas funcionan generando un flujo al que se aplican ultrasonidos, con lo que las células se cargan eléctricamente en su membrana, lo que permite que las células,
al pasar por un campo eléctrico, sean desviadas en función de su carga positiva
o negativa.
Las
condiciones de selección celular
pueden ser no inmunológicas en función
del tamaño, la complejidad , el volumen y la refringencia de la célula. Los
parámetros inmunológicos se pueden condicionar
empleando anticuerpos
fluorescentes o bolitas magnéticas. La decisión de selección se puede establecer de manera
multiparamétrica, para elegir células vivas que lleven un determinado antígeno.
Citotoxicidad por anticuerpos
Aplicaciones la separación celular
Utilización
de los gradientes de densidad.
Los
gradientes de Ficoll o de Percoll,
constituyen el primer procedimiento para la obtención de células mononucleadas
de la sangre o de la médula. Esta separación permite realizar los siguientes
exámenes celulares:
a.-
Fenotipado de leucocitos, para estudiar subpoblaciones, hemopatías malignas,
leucemias, linfomas, o para explorar un déficit inmunológico
b.- Tipaje
HLA
c.-
Cultivo mixto de linfocitos.
d.-
Estudio de poblaciones citotóxicas NK, y
K de ADCC.
e.-
Cultivo de células medulares, para eliminar células T y monocitos.
Destrucción de células por citotoxicidad
Este
procedimiento se puede emplear para eliminar de sangre periférica
leucocitos que expresen antígenos
HLA-DR. Después de un aislamiento en Ficoll, las células aisladas son incubadas
con un monoclonal contra HLA-DR, fijador
de complemento. Las células se incuban con complemento de conejo, lo que
produce la lisis de las células que hayan fijado el anticuerpo. Las células
intactas son lavadas y recuperadas en un gradiente de Ficoll. Esta técnica se puede emplear para aislar y purificar
células T, eliminado los monocitos y las células B que expresan HLA-DR.
Exploración de la respuesta
inmunológica celular
La
enumeración de los diferentes componentes celulares se puede hacer en
sangre y en otros líquidos biológicos, como L.C.R., liquido sinovial, lavado
broncoalveolar. En el momento actual estas mediciones se hacen por métodos muy
precisos, citometría de flujo o contadores automáticos, pudiéndose obtener
valores absolutos o relativos.
Algunas
pruebas celulares son difíciles de realizar y de interpretar. No existen
estándares universalmente admitidos entre unos laboratorios y otros, lo que
obliga a una estrecha colaboración entre el clínico y el inmunólogo.
Ensayos para evaluar
la función de los linfocitos
Exploración funcional de los linfocitos
Los ensayos diseñados
para medir las respuestas de células de B contra el antígeno o el estímulo mitogénico, a veces
son usados, clínicamente, para evaluar la respuesta humoral. Estos ensayos nos
ayudan a entender los mecanismos reguladores y moleculares asociados a la
activación de la célula B. También los ensayos para medir la función de las
células T son usados tanto clínicamente
como experimentalmente , desde el punto de vista proliferativo, efector y los perfiles de
citocinas.
Los ensayos
para evaluar la función de los linfocitos generalmente aportan datos sobre cómo
estas células responden a los mitógenos, a los antígenos, cómo producen
citocinas. y si producen anticuerpos.
Considerando la heterogeneidad
de las células, T los ensayos
para estudiar la funcionalidad de estas células pueden ser utilizados para
analizar subpoblaciones funcionales.
Esto es en particularmente útil en la evaluación clínica de pacientes en los
que se sospecha una inmunodeficiencia. El estudio de las células T cooperadoras suele ser el que se hace con
mas frecuencia.
La
cooperación de células T con las células B permite comprobar la capacidad de
células T para ayudar a inducir respuestas de anticuerpos. Este
ensayo mide, de manera cuantitativa, el nivel de anticuerpo producido.
Asimismo, es posible saber si las
células de T han sido activadas por los macrófagos. Los parámetros
estudiados proporcionarían datos
funcionales asociados con estas células fagocitarias. Es importante notar que
muchos de los ensayos que valoran la
función de las células T también
pueden aportar datos sobre las
citocinas producidas por estas mismas células.
Ensayos de
proliferación de linfocitos T y B
La estimulación de los linfocitos por los mitógenos provoca
en estas células la activación de rutas metabólicas que conducen a la expresión génica, la
síntesis de proteínas, la proliferación de célula, y su diferenciación. Las
respuestas proliferativas generadas en
respuesta a los mitógenos son de
naturaleza policlonal. Además, los mitógenos activan con criterio selectivo a los linfocitos B o a los
T. Por lo tanto, a diferencia de los immunógenos que activan sólo las
poblaciones de linfocitos que llevan el receptor apropiado, existen sustancias
que son activadores de células B o de células de T, independientemente de su
especificidad antigénica.
Los mitógenos
que de manera selectiva activan las células de B, como los lipopolisacáridos
(LPS) (el componente de la pared celulares de las bacterias Gram negativas), producen un estímulo policlonal en células de B en ratones. La magnitud de la proliferación celular en respuesta al
estímulo mitogénico puede ser medida
añadiendo nucleósidos marcados
con un isótopo radiactivo como la timidina tritiada al medio de cultivo y luego se puede medir
su incorporación al núcleo celular, utilizando un contador de centelleo. Así
mismo varias proteínas llamadas lectinas,
incluyendo la concanavalina (ConA) y la
fitohemaglutinina (PHA), son eficaces activadores de las células T. El Pokeweed mitogen (PWM) es otro ejemplo
de una lectina con propiedades de potente mitógeno, que estimula tanto los
linfocitos T como los linfocitos B.
Estudio de la
producción de anticuerpo por las células de B
El estímulo de los mitógenos sobre los linfocitos B puede ser usado para evaluar la capacidad de
una población de células de B para producir
anticuerpos. La técnica ELISA es el ensayo cuantitativo más comúnmente usado para medir niveles de
anticuerpo. Las células de B pueden ser estimuladas con mitógenos o
antígenos específicos “in vitro”, y cultivadas en cámaras sobre membranas de nitrocelulosa en una técnica denominada
ELISPOT (enzyme-linked immunospot). La
membrana de nitrocelulosa facilita la
captura de los anticuerpos secretados
por células de B individuales. Los precipitados de anticuerpo fijados en la nitrocelulosa pueden ser revelados usando un anticuerpo secundario, conjugado
con enzima específico para el anticuerpo. Esta técnica permite enumerar los
anticuerpos sintetizados por el linfocito B.
Ensayo para detectar células T y naturales asesinas
(NK)
Los ensayos de células
T permiten estudiar la respuesta de las diferentes poblaciones y subpoblaciones
celulares de linfocitos T. Se puede
medir la función de las células cooperadoras y su actividad sobre las
células de B, así como la activación
de los macrófagos y la cooperación
CD4-linfocito T. Los ensayos de citotoxicidad
miden la capacidad de células de T citotóxicas o células naturales
asesinas (NK) para matar células diana, marcadas con un isótopo. Las células
diana han sido previamente activadas con
un antígeno específico. El fundamento inmunológico de esta prueba se basa en el hecho de que las células NK expresan
en la membrana receptores Fc, que les permiten unirse a la región Fc de algunos isotipos de las inmunoglobulinas.
Este método mide una propiedad importante funcional de células NK, lo que se
conoce como citotoxicidad celular mediada por anticuerpos. (Antibody-Dependant-Cell
mediated-Cytotoxicity).
Función de los basófilos
Las
pruebas de degranulación de los basófilos o de la liberación de histamina,
permiten completar los test cutáneos, pero son mas costosas y complejas.
Cultivos celulares
Varios sistemas experimentales han revolucionado la capacidad de investigar sobre el desarrollo del Sistema
Inmunológico, sus propiedades funcionales y reguladoras, y los mecanismos
patológicos asociados con las inmunodeficiencias y las enfermedades
autoinmunes. Muchos de estos sistemas experimentales dependen de métodos de
cultivos de células mantenidos in
vitro. Los sistemas de cultivos celulares han facilitado el desarrollo en los años 1970 de
hibridomas, para producir anticuerpos monoclonales. El conocimiento de factores
de crecimiento necesarios para mantener células linfoides ha hecho posible
reproducir y cultivar “in vitro” células funcionalmente competentes.
Las técnicas de ADN recombinante han permitido la transferencia de genes a líneas celulares, permitiendo analizar el
comportamiento del gen transferido. Asimismo, las técnicas de ADN recombinante
han hecho posible desarrollar moléculas
y receptores genéticamente inducidos, lo
que ha permitido aclarar el comportamiento y la interacción de diferentes moléculas,
como, por ejemplo, la relación receptor/ligando.
Cultivos de células primarias y líneas
linfoides clonadas
Como en otros muchos campos de la Biología, los sistemas de
cultivos celulares han servido de instrumento esencial para conocer la respuesta, el desarrollo y las propiedades fisiológicas
de las células. La capacidad de los cultivos de células linfoides, que consisten en poblaciones heterogéneas de células
de T y células de B
(cultivables durante los períodos
limitados de tiempo) ha permitido
estudiar los mecanismos bioquímicos y moleculares que controlan muchos
rasgos importantes biológicos de las células
B y de las células T, incluyendo cambios genéticos.
La transformación de B y células de células T para generar líneas de célula
inmortalizadas, se ha logrado usando una variedad de métodos, incluyendo la
exposición de células a ciertos cancerígenos o virus (por ejemplo,
Epstein-Barr, el virus para la transformación de células de B, el virus T tipo
I de la leucemia humana para la
transformación de células T humanas).
Muchas líneas celulares se han obtenido de tumores de manera espontánea o experimentalmente (como consecuencia de la
administración de cancerígenos o de la infección de un virus).
La ventaja principal de usar líneas celulares establecidas
es la de poder obtener grandes cantidades de las mismas. Una desventaja es el
empleo de cancerígenos o células transformadas por virus que son, por definición, anormales. Muchas
células transformadas tienen un número anormal de cromosomas y, a menudo,
expresan fenotipos y propiedades funcionales no presentes en las células
normales. Un avance en la generación de
líneas celulares linfoides se produjo a
finales de los años 1970 con el descubrimiento de que líneas celulares transformadas no específicas contra una antígeno y células de T
específicas contra un antígeno, podrían ser cultivadas durante los períodos
largos de tiempo cuando un factor de crecimiento de células T, la citocina IL-2, fue incluido en los cultivos, junto con
células presentadoras de antígeno y los propios antígenos.
Este
procedimiento ofreció varias ventajas
sobre el empleo de células transformadas, ya que las células eran, desde todos
los puntos de vista normales. Por este
procedimiento se podían generar grandes cantidades de células transformadas
frente a un determinado antígeno; y ser utilizadas en investigación Muchas de estas líneas de célula de T han sido usadas en la
identificación y la caracterización bioquímica de citocinas, permitiendo
reconocer los genes que codifican para
estas proteínas.
El empleo combinado de
sistemas que permiten la reprodución de las células, los métodos de
transferencia génica y los modelos
animales, nos han ayudado a entender cómo las células linfoides
desarrollan la autotolerancia así como las mismas pueden evitar mecanismos que
inducen tolerancia, para hacerse células autorreactivas que causan enfermedad.
Modelos
de experimentación animal
Estos sistemas utilizan cepas singénicas de ratón,
con una gran variedad de perfiles genéticos, algunos de los cuales han sido genéticamente obtenidos. Algunas cepas
singénicas, tienen una predisposición innata para desarrollar una enfermedad
particular (el cáncer de mama, leucemias,
enfermedades autoinmunes, la inmunodeficiencia severa combinada). Los
animales genéticamente alterados, por otra parte, pueden ser desarrollados para expresar un gene
particular extraño (ratones transgénicos) o interferir la expresión de algún gen diana (ratones knockout). Tales
tensiones son útiles en el estudio de la expresión de un particular transferido
o en el estudio de las consecuencias de
silenciar un gen en ratones knockout.
Animales singénicos
El cruce selectivo de animales durante 20 generaciones, por
lo general conduce a la producción de un animal endogámico. Todos los animales
así obtenidos son genéticamente
idénticos. Por lo tanto, como los gemelos
idénticos, estos animales son
singénicos. Las respuestas inmunes de animales singénicos pueden ser
estudiadas en ausencia de variables asociadas con diferencias genéticas entre
ellos. Los transplantes entre los miembros de cepas singénicas siempre son
aceptados, ya que su Complejo Principal de Histocompatibilidad (Mayor
Histocompatibility Complex) es idéntico.
El conocimiento de las leyes de trasplante y el papel
del MHC como la barrera principal
genética que condiciona un
trasplante se determinaron por el empleo de animales singénicos. Los
experimentos que condujeron a la identificación de los genes de clase I y de
clase II, del CMH, cuya función principal es la de presentar los
fragmentos de péptidos antigénicos en la superficie de célula, para que puedan
ser reconocidos por células de T
antígeno específicas, tambien fuero realizados en animales singénicos.
Ratones SCID
La inmunodeficiencia severa combinada, SCID,
(Severe Combined Immunodeficiency Disease) es una enfermedad en la cual las células B y las células de T fallan en su desarrollo,
haciendo que el individuo esté gravemente comprometido en lo que concierne a
los mecanismos de defensa linfoide. En
los años 1980, en una línea de ratones consanguíneos homocigotos, scid/scid, se
desarrolló espontáneamente una mutación autosómica recesiva, causando una
deficiencia severa (SCID). A causa de la ausencia de células T funcionales y de células de B,
los ratones SCID, son capaces de aceptar células e injertos de tejido de
otras líneas de ratones y de otra
especie. Los ratones SCID, puede ser
injertado con células hematopoyéticas
humanas para crear quimeras SCID-humanas. Dichos ratones quiméricos desarrollan
células T maduras, funcionales y así como
células B procedentes de los
precursores de células hematopoyéticas
humanas. Este modelo de animal se ha convertido un instrumento de investigación
valioso, ya que esto permite manipular
el Sistema Inmunológico humano “in vivo” e investigar el desarrollo de las
células linfoides. Además, ratones SCID-HUMANOS pueden ser usados para producir
vacunas contra el virus de
inmunodeficiencia humana.
Ratones desnudos
La importancia del timo en el desarrollo de células de T
maduras puede ser demostrada
usando ratones
timectomizados en el momento del nacimiento,
irradiados, y posteriormente reconstituidos con médula ósea singénica. Tales
ratones fallan en desarrollar células de T maduras. lo que conlleva que el ratón nace sin pelo, de ahí el término
desnudo. el desarrollo de célula de T puede ser restaurado injertando a estos ratones tejido epitelial
del timo. Como en el caso de los ratones
SCID, estos modelos de animal han sido empleados en el estudio del desarrollo
de célula de T. Estos ratones también
son muy útiles para estudiar la
propagación “in vivo” de células tumorales de diferentes tejidos propios y de
otras especies, debido a la ausencia de células
T requeridas para rechazar
células extrañas.